SÉQUENÇAGE DE L'ADN

Séquençage de l'ADN

La méthode Sanger consiste à synthétiser in vitro des brins d’ADN complémentaires à l’un des brins de l’ADN que l’on veut séquencer. La technique repose sur l’incorporation d’un nucléotide modifié (un didésoxyribonucléotide, auquel il manque deux atomes d’oxygène) qui interrompt la synthèse d’ADN.

Vous devez d'abord être familier avec le principe de la réplication de l'ADN. Vous remarquerez que la technique de Sanger est fondée sur les principes naturels de cette réplication.

On prépare quatre mélanges de réactifs. Dans chacun des mélanges on incorpore :

• les brins du fragment d’ADN à séquencer,
• une amorce marquée par radioactivité,
• l’ADN polymérase,
• les quatre désoxyribonucléotides,
• et un des quatre types de didésoxyribonucléotide.

La synthèse des nouveaux brins commence avec l’amorce et se poursuit jusqu’à l’incorporation d’un didésoxyribonucléotide, ce qui bloque la suite de la synthèse. On produira ainsi un ensemble de brins radioactifs de longueurs différentes.

Les nouveaux brins d’ADN présents dans chaque mélange sont soumis à l’électrophorèse sur gel afin de permettre de séparer les brins dont la longueur ne diffère que par un seul nucléotide. On peut lire la séquence des brins nouvellement formés directement à partir des bandes formées dans le gel. Cette information permet de déduire la séquence du brin matrice de départ.